技術(shù)簡介

pUC18是一種由pBR322改造而來的質(zhì)粒載體，全長2686bp。在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（MCS)上下游含有M13正向和反向引物結(jié)合位點(diǎn)，以便于對插入的DNA片段進(jìn)行常規(guī)測序。本方法采取同源重組的策略代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TA克隆，實(shí)現(xiàn)對任何PCR片段的快速克隆。

質(zhì)粒圖譜

克隆位點(diǎn)

PCR產(chǎn)物插入位點(diǎn)（SalI/XbaI）：

構(gòu)建流程

一、注冊登錄

1. 登錄SMART載體快速構(gòu)建系統(tǒng)地址：http://49.234.53.21/login（僅PC端使用）；

2. 點(diǎn)擊登錄框新用戶注冊，填寫紅色*必填項(xiàng)，點(diǎn)擊注冊即完成注冊。

二、訂單預(yù)填

1. 進(jìn)入“我的訂單”，點(diǎn)擊右側(cè)的“新增”按鈕，進(jìn)入新增訂單界面。在此界面可以查詢所有快構(gòu)載體信息、訂單預(yù)填或者提交訂單。

2. 在“載體名稱”處選擇目標(biāo)載體（支持模糊查詢：隨著輸入字符的增加，縮小待選范圍）。

3. 下拉框選擇填入“CAB04-pUC18-PCR產(chǎn)物快速克隆”，然后在“上游位點(diǎn)”選擇填入SalI位點(diǎn)，在“下游位點(diǎn)”選擇填入XbaI位點(diǎn)。

4. 在“樣品名稱”里輸入5個(gè)字符（為了避免和其他客戶樣品混淆，字母和數(shù)字組合使用），并將此名稱命名在寄送的已純化的PCR產(chǎn)物管子上。

5. 在“插入片段”里填入預(yù)估的插入片段DNA堿基數(shù)。

6. “是否已經(jīng)純化”：是：強(qiáng)烈建議提供已經(jīng)電泳切膠純化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR產(chǎn)物（未純化的樣品在運(yùn)輸和后續(xù)操作過程中有可能出現(xiàn)降解等意外情況）。否：提供含同源臂的PCR原液100ul或電泳切膠后含單一目標(biāo)條帶的膠塊，另收10元/樣的純化費(fèi)。

7. “陽性克隆數(shù)”：客戶提交訂單時(shí)可以填寫一次性測序多少個(gè)陽性克隆，轉(zhuǎn)導(dǎo)生物也會根據(jù)實(shí)際提供的陽性克隆數(shù)進(jìn)行更改。

8. “插入片段序列”： 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單需要粘貼待插入的整個(gè)目標(biāo)序列（連同預(yù)計(jì)的同源臂及兩端額外5-10個(gè)堿基），用于測序結(jié)果分析比對；在第三方測序的，可以不粘貼序列，隨便輸入一個(gè)字符代替。

9. 點(diǎn)擊右下方的“保存”按鈕。此訂單的相應(yīng)數(shù)據(jù)將作為草稿保存。如果后續(xù)需要修改此訂單，可以點(diǎn)擊“編輯”進(jìn)行更改。

三、準(zhǔn)備待待克隆的PCR片段

A. 分別在用于擴(kuò)增的正反引物的5’端直接加上同源臂序列(直接復(fù)制粘貼無需反向互補(bǔ))：5'TTGCATGCCTGCAGGTCGAC和5'GTACCCGGGGATCCTCTAGA。

    如下：ABC01F: TTGCATGCCTGCAGGTCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNN

             ABC01R: GTACCCGGGGATCCTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNN

             N代表用于特異擴(kuò)增的特異引物序列。

A. 盡量使用優(yōu)質(zhì)的高保真酶擴(kuò)增目標(biāo)片段（為了減小堿基突變概率，盡量不用含有Taq酶的PCR酶）。（客戶自主完成）；

B. 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并切膠目標(biāo)條帶后純化回收。如果條帶比較弱，建議多做幾個(gè)體系的PCR產(chǎn)物，純化回收時(shí)用少量水反復(fù)過柱濃縮。

C. 已經(jīng)純化好的PCR樣品準(zhǔn)備好后，通知收樣員收樣。

D. 在“我的訂單”向右橫向拖拉直至看到“代理/收樣員”。直接電話聯(lián)系收樣員（沒有收樣員的地區(qū)請低溫快遞至指定地址，拒絕到付件）。

四、克隆及測序

1. 樣品送出后，在“我的訂單”頁面找到相應(yīng)訂單，點(diǎn)擊目標(biāo)訂單最右側(cè)的“編輯”按鈕，提交處于保存狀態(tài)的訂單。（注意：A.如果是新客戶，客戶信息在還沒有通過審核的情況下，訂單提交功能還沒有開通，請及時(shí)聯(lián)系轉(zhuǎn)導(dǎo)生物工作人員；B.一旦提交訂單，客戶將不能修改此訂單，如果需要修改調(diào)整，請通過官方QQ4000275066聯(lián)系工作人員）。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)生物在收到樣品的2個(gè)工作日內(nèi)完成克隆構(gòu)建實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)入下游的測序環(huán)節(jié)。

3. 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單：提供陽性克隆甘油菌一份+小提保種質(zhì)粒一份，收基礎(chǔ)構(gòu)建費(fèi)用+40元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費(fèi)用（5毛/堿基）；轉(zhuǎn)導(dǎo)生物還負(fù)責(zé)測序數(shù)據(jù)的整理、比對和結(jié)果展示。

4. 指定第三方公司（武漢奧科鼎盛）測序的訂單：僅提供陽性克隆甘油菌一份，收基礎(chǔ)構(gòu)建費(fèi)用+10元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費(fèi)用（5毛/堿基）；構(gòu)建成功后，直接交由第三方測序公司完成1個(gè)通用引物測序，并發(fā)送至客戶郵箱，客戶審視結(jié)果后，如需加測請客戶自行郵件溝通；根據(jù)實(shí)測反應(yīng)數(shù)（10元/反應(yīng)）和加測引物堿基數(shù)（0.5元/bp），轉(zhuǎn)導(dǎo)直接收取相應(yīng)費(fèi)用，客戶不需要向第三方測序公司支付。

五、結(jié)算和交付

1. 測序完成后，客戶審視實(shí)驗(yàn)結(jié)果。確定無誤后，轉(zhuǎn)導(dǎo)生物根據(jù)實(shí)際測序反應(yīng)數(shù)和加測引物堿基數(shù)（通過訂單詳情頁可查看），再次核算結(jié)算金額并核銷收取相應(yīng)費(fèi)用。

2. 結(jié)算完成，請通過官方QQ400027506通知交付相應(yīng)的陽性克隆甘油菌1ml（轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單還另含對應(yīng)的一份小提質(zhì)粒）。